丹参幼根小RNA的鉴定及小RNA通路关键酶基因家族的系统分析

【摘要】小RNA在植物生长发育、病毒防御和胁迫应答等多个方面发挥重要作用。近年来对小RNA功能和作用机制的研究已成为生命科学研究的热点之一。丹参是种重要的传统中药,有多种药理功能,相对来说具有染色体少、基因组小、生育周期短、生长条件简单等特点,正成为模式药用植物。目前有关丹参小RNA种类鉴定和作用机制的研究尚未报道,本文主要进行了丹参幼根小RNA的鉴定及小RNA通路中关键酶基因家族的系统分析,旨在为深入了解小RNA在丹参生长发育过程中的作用和小RNA对丹参抗病抗逆性的影响奠定基础,进而为丹参的栽培育种提供理论指导。本研究通过建立丹参幼根不同发育时期的小RNA文库和降解组文库,分析丹参幼根保守的miRNA、新的miRNA和ta-siRNA,鉴定差异表达的miRNA,预测和验证了这些小RNA的靶基因；利用生物信息学技术和RACE技术对小RNA产生和作用途径关键酶基因AGO、DCL和RDR家族进行了生物信息学分析和全长克隆,并对这些基因进行了表达分析和转录后调控分析；采用RNAi技术构建了丹参DCL1和DCL2的RNAi载体,建立了丹参的遗传转化体系。获得了以下主要结果：1.构建了丹参幼根5个不同发育时期的小RNA文库,分别获得了22096287、24477247、22789461、23216990和21846663条cleanreads,从中鉴定了176个分属于39个家族的保守miRNA,鉴定了552个新的miRNA,发现了26个miRNA介导产生ta-siRNA的70个TAS位点。2.基于转录组数据,预测了196个丹参幼根保守miRNA的靶基因；结合降解组数据验证了8个靶基因；将丹参幼根的5个小RNA文库进行均一化,分析丹参根中差异表达的保守miRNA基因,结果发现niR156、miR164、miR166、miR167.miR168、miR169、miR172、miR390、miR396、miR408、miR4414、miR479、miR160、miR2118、miR1446和miR5225可能参与丹参幼根的发育。3.DCL是小RNA合成途径的关键组分,通过生物信息学分析,我们在丹参中预测了5个DCL基因,并利用RACE技术克隆得到了全长cDNA,我们分析了这些新确定DCL的序列特征、基因结构、保守结构域、系统进化关系、组织表达情况以及转录后调控分析,结果我们发现丹参中没有miR162,同时也没有miR162的靶位点。进一步研究发现在古老植物中不存在miR162的靶位点,miR162的靶位点是在植物的进化过程中获得,随着进化又有一部分植物丢失。我们的结果为miR162及其靶位点在植物进化过程中的获得和丢失提供了证据。,4.AGO是小RNA沉默复合体的核心组分,我们在丹参中预测了10个AGO基因,并利用RACE技术克隆得到了全长cDNA,这使得丹参的AGO成为第一个整个家族得到验证的cDNA,我们分析了这些新确定的AGO的序列特征、基因结构、保守结构域、系统进化关系以及组织表达情况。此外我们利用小RNA数据库对AGO的cDNA进行了靶基因预测,并利用5,RACE技术进行验证,结果表明是SmAGO1和SmAG02分别是miR168和miR403的靶基因。5.RDR在siRNA的合成途径中起着关键作用,我们从基因组范围鉴定了丹参5个RDR基因,并利用RACE技术克隆得到了全长cDNA,我们分析了这些新确定的RDR的序列特征、基因结构、保守结构域、系统进化关系、组织表达情况以及对茉莉酸甲酯和黄瓜花叶病毒的胁迫响应情况,结果表明丹参RDR对茉莉酸甲酯和黄瓜花叶病毒的胁迫均有响应,为进一步研究RDR的功能提供了基础。6.构建了DCL1和DCL2的RNAi载体,建立了丹参的遗传转化体系,经实验摸索丹参遗传转化的优化条件为用OD值为0.5的农杆菌菌液1mL稀释20倍后侵染生长状态良好的丹参叶片,侵染时间为2分钟,共培养时间为60个小时,潮霉素的筛选浓度为10mg/L
【作者】邵芬娟；
【导师】卢善发；
【作者基本信息】北京协和医学院，生药学，2014，博士
【关键词】丹参；miRNA；ta-siRNA；DCL；AGO；RDR；

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